F4 ошибка висман: Что означает ошибка f4 газового котла Viessmann (Висман)

Резюме

Репрессия транскрипции ключевых регуляторных генов растений имеет решающее значение. и развитие животных.Ранее мы идентифицировали и выделили два Корепрессоры транскрипции Arabidopsis LEUNIG (LUG) и SEUSS (SEU), которые функционируют вместе в предполагаемый корепрессорный комплекс для предотвращения эктопического АГАМОЗА (AG) транскрипция в цветах. Потому что ни LUG, ни SEU не обладают узнаваемый ДНК-связывающий мотив, как они привязаны к конкретной мишени промоутеры остаются неизвестными. Используя дрожжевой двухгибридный анализ и Анализ коиммунопреципитации показал, что APETALA1 (AP1) и SEPALLATA3 (SEP3), оба ДНК-связывающих белка MADS-бокса, взаимодействовал с ГЭУ.Белок-белковое взаимодействие AP1-SEU было поддерживается синергетическим генетическим взаимодействием между ap1 и seu мутации. Роль белков SEU в наведении мостиков на взаимодействие между AP1 / SEP3 и LUG для подавления транскрипции гена-мишени было дополнительно продемонстрировано на дрожжевых и растительных клетках, обеспечивая важные механистические понимание корепрессорной функции у растений. Кроме того, прямой in vivo была обнаружена ассоциация белков SEU с цис-регуляторным элементом AG. проявляется иммунопреципитацией хроматина.Соответственно, репортерный ген, управляемый цис-элемент AG был способен отвечать на AP1- и SEP3-опосредованная репрессия транскрипции в временной растительной клетке система при поставке с SEU и LUG. Эти результаты предполагают, что AP1 и SEP3 могут служить ДНК-связывающими партнерами SEU / LUG. Наш демонстрация прямого физического взаимодействия между SEU и С-концевой домен SEP3 и AP1 предполагает, что белки MADS-бокса AP1 и SEP3 могут взаимодействовать как с положительными, так и с отрицательными регуляторными белками через свои С-концевые домены, чтобы стимулировать или подавлять их регуляторные домены. цели.

ВВЕДЕНИЕ

Генетический контроль идентичности органов цветка является одним из наиболее важных примеры того, как регуляторные гены определяют структуру растений. Конкретный комбинации генов классов A, B, C и E направляют развитие чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистики в четырех концентрических цветочных мутовках, соответственно (Коэн и Мейеровиц, 1991; Джек, 2004; Тайссен и Сэдлер, 2001). Почти все гены ABCE кодируют факторы транскрипции MADS-бокса MIK-типа, которые могут взаимодействовать друг с другом с образованием мультимерных комплексов для активации генов (Хонма и Гото, 2001; Тайссен и Сэдлер, 2001). Было предложено четыре различных мультимерных белковых комплекса, состоящих из Комбинации белков A / E, A / B / E, B / C / E и C / E контролируют четыре органа типоспецифическая разработка (Тайссен и Saedler, 2001). Важным аспектом этой модели является то, что A, B гены класса C транскрибируются только в определенных цветочных завитках; их выражение коррелирует с областью их функции. Домен или whorl-специфическая экспрессия генов A, B и C, таким образом, лежит в основе образование специфичных для оборотов комплексов MADS box.

Ранее мы идентифицировали и охарактеризовали две транскрипционные корепрессоры, LEUNIG (LUG) и SEUSS (SEU), которые играют решающую роль в предотвращении эктопической экспрессии ген класса C AGAMOUS (AG) (Franks et al., 2002; Лю и Мейеровиц, 1995). В дикого типа, AG экспрессируется во внутренних двух оборотах цветка до указать развитие тычинок и плодолистиков (Боуман и Мейеровиц, 1991; Дрюс и др., 1991; Янофский и др., 1990). В эктопическая экспрессия AG в lug или seu мутантах в все четыре цветковых мутовки вызывают частичные гомеотические преобразования мутовки 1 чашелистиков в плодолистные чашелистики и заверните 2 лепестка в стаминоидные органы или потеря органа.lug и seu продемонстрировали синергетический генетический взаимодействие, вызывающее более полное гомеотическое преобразование чашелистиков в плодолистиков, и более серьезное сокращение цветковых органов в lug seu двойные мутанты (Franks et al., 2002; Лю и Мейеровиц, 1995), предполагая, что LUG и SEU частично избыточно в контроле экспрессии AG.

LUG кодирует ядерный белок с общей доменной структурой аналогичен классу функционально связанных транскрипционных ко-репрессоров, включая Tup1 дрожжей и Граучо Drosophila (Коннер и Лю, 2000; Hartley et al., 1988; Уильямс и Трумбли, 1990). Кроме того, LUG обладает консервативным N-концевым 88-аминокислотным доменом, названным домен LUFS. N-концевая половина домена LUFS соответствует Lis1-гомологичный (LisH) домен, который первоначально был идентифицирован в серии белки, связанные с болезнями человека (Emes and Ponting, 2001) и впоследствии было показано, что способствует димеризации, тетрамеризации и взаимодействие с другими белками (Cerna и Уилсон, 2005). SEU кодирует белок, богатый глутамином (Q). с консервативным доменом, который подобен домену димеризации LIM-домен-связывающее (Ldb) семейство ко-регуляторов транскрипции, таких как Ldb1 у мыши и чипа у дрозофилы (Franks et al., 2002). ГЭУ был показано, что напрямую взаимодействует с доменом LUFS LUG (Sridhar et al., 2004) и может образуют корепрессорный комплекс с LUG у Arabidopsis (Franks et al., 2002; Sridhar et al., 2004). Этот комплекс, вероятно, будет эволюционно консервативен, поскольку прямое взаимодействие между STYLOSA (STY), ортологом LUG в Сообщалось о Antirrhinum и AmSEUSS (Navarro et al., 2004).

Сильная репрессорная активность LUG была продемонстрирована путем привязки LUG к гетерологичным промоторам репортерных генов через GAL4 ДНК-связывающий домен (BD) в дрожжах и растительных клетках (Шридхар и др., 2004). В Было показано, что репрессорная активность LUG зависит от гистоновых деацетилаз. (Шридхар и др., 2004). От напротив, SEU не проявлял репрессорной активности, когда был аналогичным образом связаны с гетерологичными промоторами репортерных генов через GAL4-BD. Поскольку ни LUG, ни SEU не обладают узнаваемым ДНК-связывающим мотивом, как они привязаны к конкретным промоторам-мишеням in vivo, остается неизвестным. Кроме того, поскольку LUG и SEU широко выражаются в как цветы, так и вегетативные ткани (Коннер и Лю, 2000; Franks et al., 2002), как LUG и SEU наделяют свой внешний репрессор, специфичный для оборотов. активность на AG неизвестна. Одна привлекательная модель, учитывающая оба из этих вопросов заключается в том, что предполагаемый комплекс LUG / SEU взаимодействует с ДНК-связывающими партнерами, которые специфически экспрессируются в двух внешних мутовки цветка. Вторая модель заключается в том, что LUG / SEU может регулировать AG косвенно, подавляя экспрессию позитивных регуляторов AG. Третья модель предполагает, что SEU / LUG подавляет AG во всех четырех цветочных мутовках и некоторые факторы во внутренних двух Whorls способны противодействовать репрессорному эффекту LUG / SEU.

APETALA1 (AP1) и SEPALLATA3 (SEP3), оба белка MADS-бокса принадлежат к идентичности цветочных органов классов A и E гены, соответственно, и было показано, что они активируют экспрессию B и C гены класса (Castillejo et al., 2005; Гомес-Мена и др., 2005; Вайгель и Мейеровиц, 1993). В этом исследовании мы демонстрируем прямые SEU-AP1 и SEU-SEP3 белок-белковое взаимодействие, а также синергетические генетические взаимодействия между мутациями seu и ap1, что указывает на то, что AP1 и SEP3 могут действовать как ДНК-связывающие партнеры LUG / SEU.In vivo ассоциация SEU к цис-регуляторным элементам AG, показанным хроматином иммунопреципитация устраняет вторую модель косвенной роли SEU / LUG в регулировании AG. Предлагается доработанная третья модель. иллюстрируя, как происходит репрессия AG, специфичная для внешних оборотов. достигнуто.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дрожжевой двугибридный анализ

Штаммы дрожжей PJ69-4A (James et al. al., 1996) и SEU-BD были описаны ранее. (Шридхар и др., 2004). AP1-AD и SEP3-AD в pACT2 (Хонма и Гото, 2001), PI-AD (pD1293) в pGAL4-C и AP3-BD (pD1294) в pGBDU-C (Ян и др., 2003) были подарками от докторов К. Гото и Т. Джека, соответственно.

Чтобы сконструировать AP3-AD, AP3 вырезали из pD1294 как BamHI / PstI фрагмент и вставлен в pGAL4-C в те же сайты. AP1-MIK и SEP3-MIK были вырезаны из AP1-AD и SEP3-AD в pACT2 (Хонма и Гото, 2001) в качестве Фрагмент NcoI / SacI и клонирован в pET30a (Novagen) на тех же сайтах. Впоследствии соответствующий фрагмент MIK был вырезан как Фрагмент NcoI / XhoI сверху pET30a-MIK и вставлен в pGADT7 (Clontech).AP1-C и SEP3-C были вырезаны из AP1-AD и SEP3-AD в pACT2 (Хонма и Гото, 2001) как SacI / XhoI фрагмент и клонирован в pET30a и pET30c на тех же сайтах соответственно. Впоследствии AP1-C и SEP3-C были вырезаны как фрагмент NcoI / XhoI и клонировали в pGADT7 (Clontech).

Дрожжевой двугибридный анализ выполняли, как описано ранее. (Sridhar et al., 2004) .β -галактозидазную активность измеряли в трех экземплярах с помощью прибора Galacto Light Plus Kit (Applied Biosystems) и нормализованный с OD культура.

Анализ репрессии дрожжей

Полноразмерная кДНК SEU была вырезана из HFFL # 7 (Sridhar et al., 2004) с HindIII / XhoI и вставлен в p426GALL (Mumberg et al., 1994). Как В результате SEU был продиктован промоутером GALL и его экспрессия индуцируется галактозой. LUG и LUG _дельта LUFS экспрессировались из pGAD424 (Clontech), но с удаленным доменом GAL4-AD. В частности, КПНИ и SmaI использовались для переваривания LUG-AD и LUG _delta LUFS-AD в pGAD424 (Шридхар и др., 2004), и пригнано удалить GAL4-AD. PGAD _дельта 424 контрольный вектор обрабатывали аналогичным образом для удаления GAL4-AD из pGAD424 (Clontech). AP1-BD в pAS2-1 был подарком от доктора К. Гото (Хонма и Гото, 2001). SEP3-BD был сконструирован путем переваривания SEP3. в pACT2 (Хонма и Гото, 2001) с NcoI / Xho1. В Фрагмент NcoI / XhoI был клонирован в pGBTK7. (Clontech) на сайтах NcoI / SalI.

Для штамма дрожжей PJ69-4A (James et al., 1996), трансформация дрожжей и анализ β-галактозидазы были проводится аналогично дрожжевому двугибридному анализу.AP1-BD или SEP3-BD был выбран -Trp, а LUG или LUG _delta LUFS был выбран -Leu. ГЭУ был выбранный Ura3, и его экспрессия была вызвана добавлением галактозы вместо глюкозы в СМИ. Данные показаны в Рис. 3A - средние значения трижды, и эксперимент повторяли дважды.

Выпадающий анализ in vitro

His-меченные AP1 и AP3 были подарены доктором X. Chen (U.C. Риверсайд). Полноразмерные кДНК AP1 и AP3 были клонированы в сайты EcoRI / BamHI в pRSET (Invitrogen).API-C и SEP3-C были вырезаны из AP1-AD и SEP3-AD в pACT2 (Хонма и Гото, 2001) как фрагмент SacI / XhoI и клонирован в pET30a и pET30c (Novagen) соответственно. Полная длина SEP3 был вырезан из SEP3-AD в pACT2 как NcoI / XhoI и клонировали в те же сайты pET30a (Novagen).

Плазмидные матрицы были использованы для синтеза ³⁵ S-радиоактивно меченных Белки AP1, SEP3 и AP3 с TnT Quick Coupled Система транскрипции / перевода (Promega). Реакционная смесь TnT (5 мкл) была загружали непосредственно на гель NuPAGE (Invitrogen) в качестве входного контроля.Для двухбелковый вытягивающий белок GST-SEU был очищен от бактерий, как ранее описано (Sridhar et al., 2004 г.). Белок GST-SEU (5 мкг), связанный со смолой GST.Bind (Novagen) инкубировали с 15 мкл реакционной смеси ³⁵ S из TnT для 2 часа при комнатной температуре. Связанную GST-SEU смолу промывали пять раз. с холодным 1 × PBS, ресуспендировали в загрузочном буфере белкового геля, нагревали и загружали непосредственно в гель NuPAGE (Invitrogen) и запускали в течение 3 часов при 70 V.

Для раскрытия трех белков белки MBP и MBP-LUFS очищали от бактерии, как описано ранее (Шридхар и другие., 2004). Белки MBP-LUFS были связаны с гранулами амилозы. После интенсивной промывки холодным 1 × PBS, 10 мкл MBP-LUFS / гранул амилозы оценивались по концентрации белка. MBP-LUFS / гранулы амилозы (5 мкг) затем инкубировали при 4 ° C в течение двух часов с 5 мкг SEU-GST, элюированными из смолы GST.Bind, а также 15 мкл ³⁵ S-меченного AP3, SEP3 или AP1 от TnT. Смолу MBP-LUFS / амилозу пять раз промывали холодной водой. 1 × PBS, ресуспендировали в загрузочном буфере белкового геля, нагревали и затем загружали на гель NuPAGE.

Анализы репрессии в растениях

Для конструирования репортера pAG3'I :: LUC, пара праймеров AGdF (5'-TGGTCTGCCTTCTACGATCC-3 ') и AGdR (5'-TTAATTTCTGCCACCGATCC-3 ') использовали для амплификации ∼900 п.н. AG 3 'энхансер с использованием геномной ДНК Колумбии в качестве матрицы. В Продукт ПЦР был ТА-клонирован в pCRII-TOPO (клон № 27). ∼900 п.н. Фрагмент AG был вырезан из клона № 27 с помощью KpnI / XhoI и вставлен в -58 / LUC, подарок доктора Крижек. -58 / LUC был сконструирован путем вставки -58 / + 6 фрагмента промотор 35S в сайт BglII pGL3 (Promega), уничтожение участка BglII (Крижек и Солли, 2006).

Полноразмерные AP1 и SEP3 были вырезаны как Фрагмент NcoI / XhoI из их соответствующего pACT2 плазмиды (Хонма и Гото, 2001) и вставлен на сайты NcoI / XhoI пСПУТК (Стратаген). AP1 и SEP3 впоследствии были вырезан из pSPUTK как фрагмент HindIII / XbaI, и клонирован в pART7 (Gleave, 1992) на тех же участках с получением 35S :: AP1 и 35S :: 3 сентября. 35S :: LUG был описан ранее (Шридхар и др., 2004). 35S :: SEU был построен путем изъятия SEU из HFFL # 7 (Sridhar et al., 2004) как фрагмент SalI / XbaI и вставлен в pART7 на тех же сайтах.

Один микрограмм pAG3′I :: LUC, 100 нг 35S :: Renilla LUC, 1 мкг 35S :: AP1 (или 35S :: SEP3), Смешивали 1 мкг 35S :: SEU и 2 мкг 35S :: LUG и введены в эпидермальные клетки лука путем бомбардировки частицами после протокол Padmanabhan et al. (Padmanabhan et al., 2005). Общую ДНК поддерживали постоянной на уровне 5 мкг на трансформацию с использованием pART7 вектор, чтобы компенсировать разницу между преобразованиями. Нарезанный кубиками лук подвергали бомбардировке с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 16-20 часов. часов в чашке Петри, содержащей влажную бумагу 3 мм.Удалены эпидермальные пилинги. из лука, измельченного, лизированного буфером для пассивного лизиса и проанализированного с помощью Система анализа репортеров двойной люциферазы (Promega). Данные, представленные в Рис. 3C - средние значения трехкратные анализы. Опыт повторяли дважды.

Генетический анализ

двойных мутантов seu-1 ap1-1 и seu-1 ap1-3 построенный путем пересечения ap1-1 или ap1-3 с seu-1. Семена ap1-подобных растений F2 собирали индивидуально. Эти ap1-подобные растения можно разделить на три типа.Растения типа I были одиночные мутанты ap1, которые продуцировали 100% ap1 в F3. Тип II растения демонстрировали более тяжелый фенотип, чем одиночные мутанты ap1 и разделили три типа потомства в F3, предполагая, что тип II был гомозиготен по ap1, но гетерозиготен по seu-1. Тип III растения проявляли наиболее тяжелый фенотип и давали потомство F3, которое все похожи на своих родителей, что указывает на то, что тип III гомозиготен по ap1-1 и seu-1. Паттерны сегрегации этих мутантов были проверены в F4.

Иммунопреципитация хроматина

Было получено куриное антитело против SEU (AA126-139A), подаренное доктором Фрэнксом. от Gallus Immunotech против пептида (CNQLLAEQQRNKKMEKLH), расположенного в N-концевой домен SEU.Чтобы очистить антитело против SEU, 20 мкг очищенного SEU-GST из бактерий наносили на нитроцеллюлозную мембрану, а затем блокируется 10% молоком в 0,01% Tween-TBS (TTBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембрану пять раз промывали TTBS и инкубировали с 1 мл сырого сыворотка против SEU в течение ночи при 4 ° C. После тщательной промывки TTBS связанное антитело элюировали 500 мкл 0,2 М глицина (pH 2,8) и немедленно нейтрализовали 50 мкл 1 М трис-HCl (pH 8,0). Очищенный антисыворотку концентрировали до 20 мкл с использованием центробежного фильтра Micon. устройство (Millipore).

Иммунопреципитация хроматина выполнялась в основном, как описано Kwon et al. (Квон и др., 2005). Дикий тип (Ler, 1,8 г) и seu-3 (1,8 г) соцветия фиксировали 1% формальдегидом на 2 часа. Одна двадцатая элюированную ДНК использовали для ПЦР (94 ° C в течение 1 минуты; затем 35 циклов 94 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 40 секунд и 72 ° C в течение 40 секунд). Пара праймеров AG-3 (5'-CTATGTACAAGTACATATACAGGAAACTC-3 'и 5′-GATAGGGTCAAATCGACCACTTGCACAG-3 ′) усиливает 3 ′ Второй интрон AG.Пара праймеров AG-5 (5'-GCCGTGGTCGTCTCTATGAGTACTCTAAC-3 'и 5'-CTCCACATTAGAAAAAACCCTGATGG-3 ') усиливает 5' Второй интрон AG. Контрольный праймер E1F4P был основан на этом описанный Kwon et al. (Квон и др., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ

SEU взаимодействует с AP1 и SEP3 в дрожжах и in vitro

Чтобы проверить нашу первую модель того, как предполагаемый комплекс LUG / SEU может взаимодействовать со специфическим для оборота цветочным генным продуктом с ДНК-связывающей активностью, мы провели дрожжевой двугибридный анализ против нескольких ДНК-связывающих транскрипций факторы развития цветка, в том числе AP1, APETALA2 (AP2), ЛИФИ (LFY) и БЕЛЛРИНГЕР (BRL) (Bao et al. , 2004; Джофуку и др., 1994; Mandel et al., 1992; Weigel et al., 1992). Хотя LUG не смог взаимодействовать ни с одним из протестированных белков (данные не показаны), SEU сильно взаимодействовал с AP1 (рис. 1А). Тестировать специфичность взаимодействия между SEU и AP1, другие гены MADS-бокса, принадлежащие к классам B и E, впоследствии были проверено. Обнаружено сильное взаимодействие между SEU и SEP3. (Рис. 1А). Однако взаимодействие между SEU и AP3 или PI не было обнаружен (рис. 1А). В взаимодействие между SEU и белком AP1 или SEP3 было подтверждено in vitro вытяжной анализ. ³⁵ S-меченый AP1, SEP3 или AP3 был связан с SEU-GST смолы. После отмывки AP1 и SEP3, но не AP3, удерживались SEUGST. смолы (рис. 1С).

Взаимодействие между SEU и AP1 / SEP3 в дрожжах и в пробирка. (A) Анализ дрожжевого двугибридного взаимодействия, показывающий положительный взаимодействия между приманкой SEU-BD и AP1-AD или SEP3-AD жертва. Усеченный SEU без Q2 и C-терминала домены использовались при построении SEU-BD, которые больше не самоактивируется в дрожжах (Sridhar et al., 2004 г.). Полноразмерные AP1, SEP3, AP3 и PI были слит с GAL4-AD. Активация HIS3 и lacZ есть обозначается ростом на среде -HIS и синим цветом соответственно. красный колонии указывают на отсутствие активации репортера ADE2 (Джеймс и др., 1996). В Показано, что относительный уровень активности lacZ (β-галактозидазы) право. (B) Аналогичный анализ двугибридного взаимодействия дрожжей, показывающий положительные взаимодействия между SEU-BD и C-концевым доменом AP1 и SEP3 (AP1-C и SEP3-C). (C) Выпадающий анализ in vitro, показывающий ³⁵ S-меченные белки AP1 и SEP3, удерживаемые GST-SEU (справа).Равные количества транслированных in vitro продуктов загружали в гель NuPAGE. (Дорожки ВВОДА). Один только GST не смог сохранить ни один из белков ³⁵ S (данные не показаны). (D) Анализ трех белков с SEU-GST. служащий связующим белком. Способность MBP-LUFS / гранул амилозы удерживать ³⁵ S-меченные AP1, SEP3 или AP3 тестировали в присутствии (+) или отсутствие (-) SEUGST. MBP использовали в качестве отрицательного контроля.

Для определения домена AP1 или SEP3, который взаимодействует с SEU, AP1 и Каждый SEP3 был разделен на N-концевой MIK (MADS-бокс, промежуточная область, и K-box) домен и C (карбоксильный) домен.В дрожжах SEU не взаимодействуют либо с AP1-MIK, либо с SEP-MIK, но взаимодействуют с AP1-C и SEP3-C (Рис. 1B). Взаимодействие SEU с концом C AP1 или SEP3 слабее, чем с полноразмерным AP1 или SEP3 (сравните Рис. 1A с 1Б). Это более слабое взаимодействие подтверждается исследованиями in vitro. выпадающий анализ (рис. 1С). Есть два возможных объяснения слабого взаимодействия между SEU и AP1-C или SEP3-C. Во-первых, усечения белка AP1-C или SEP3-C могут быть менее стабильными. чем полноразмерные белки.Во-вторых, AP1 или SEP3 может потребовать гомо- или гетеродимеризация с целью прочного взаимодействия с SEU. Димеризация вероятно, отсутствует для этих усечений С-конца.

С-концевой домен является наиболее дивергентным доменом белков MADS-бокса. без очевидного сходства последовательностей между AP1, SEP3, AP3 и PI, за исключением того, что AP1-C и SEP3-C богаты глутамином (Q). Еще неизвестно, если глутамины в AP1-C и SEP3-C важны для взаимодействия с SEU, который также является Q-богатым.Отсутствие взаимодействия между SEU и Белки класса B AP3 или PI предполагают, что SEU может специфически взаимодействовать с подмножество белков MADS-бокса, включая AP1 и SEP3. Однако наш анализ не мог исключить возможность того, что AP3 / PI гетеродимеры могут взаимодействовать с SEU.

SEU связывает LUG и AP1 / SEP3

Если SEU, но не LUG, взаимодействует с AP1 и SEP3, может ли SEU соединить взаимодействие между LUG и AP1 или SEP3? Это было проверено методом выпадения in vitro. анализы с использованием LUFS-домена LUG, помеченного мальтозосвязывающим белком (MBP).Ранее было показано, что домен LUFS для LUG необходим и достаточен для взаимодействуя с SEU (Sridhar et al., 2004 г.). Взаимодействие между LUFS-MBP и ³⁵ S-меченым AP1, SEP3 или AP3 тестировали в присутствии или в отсутствие очищенного SEU (Рис. 1D). В отсутствии SEU, LUFS-MBP / амилозная смола не удерживает ни одного из ³⁵ S-меченых Белки AP1, SEP3 и AP3. Напротив, когда был добавлен SEU, ³⁵ S-меченные AP1 и SEP3, но не ³⁵ S-меченные AP3, были удерживается смолой LUFS-MBP / амилоза.Взаимодействие специфично для LUFS, поскольку только MBP не может взаимодействовать с AP1 или SEP3, даже в присутствии SEU (Рис. 1D).

Генетические взаимодействия между ap1 и seu

Если AP1 является ДНК-связывающим партнером LUG / SEU при репрессии AG, и частичное функциональное дублирование существует между AP1, LUG и SEU, мутации ap1 могут проявлять синергетическое генетическое взаимодействие с lug и seu. Синергетическое генетическое взаимодействие между lug-1 и ap1-1 сообщалось ранее (Лю и Мейеровиц, 1995).А более резкое превращение чашелистиков в плодолистики и более серьезное редукция оборота на 2-3 органа наблюдалась в луг-1 ап1-1 двойной мутанты. Усиленный фенотип коррелировал с усилением эктопической Экспрессия AG в двойных мутантах lug-1 ap1-1 (Лю и Мейеровиц, 1995).

Мы сконструировали двойные мутанты seu-1 ap1 с использованием слабого ap1-3. (Рис. 2C) и сильное ap1-1 (Рис. 2G, H) аллели. Генетическая синергия более разительна между слабыми ap1-3. и seu-1. Как одиночные мутанты seu-1, так и ap1-3 являются плодородны и развивают лепестки в обороте 2 (рис.2А-С). У махровых мутантных цветков ap1-3 seu-1, оборот 1 органы превращаются в плодолистные органы с роговидными выступами и обороты 2 органов отсутствуют (рис. 2E). Двойные мутанты образуют маленькие силикаты и демонстрируют пониженный плодородие. Кроме того, растения ap1-3 / ap1-3, гетерозиготные по seu-1 (то есть ap1-3 / ap1-3; seu-1 / +) показал гораздо более сильную цветочный фенотип по сравнению с одиночными мутантами ap1-3 (Рис. 2F). В добавок к цветочный фенотип, также поражается высота растений, с ap1-3 / ap1-3; seu-1 / + составляет 75% высоты одиночных мутантов ap1-3 и ap1-3 seu-1 двойные гомозиготы, составляющие 50% высоты Простые мутанты ap1-3 (рис. 2D). одиночные мутанты seu-1 похожи на seu-1 ap1-3 в высоту. В целом двойные мутанты seu-1 ap1-3 показали цветочный фенотип похож на seu-1, но более серьезен, что предполагает что ap1-3 усиливает seu-1 в идентичности цветочных органов Технические характеристики.

Синергетические генетические взаимодействия между seu и ap1. (A) Цветок seu-1. (B) An соцветие сеу-1. (C) Цветок ap1-3. (D) Сравнение высоты растений ap1-3, гетерозиготных или гомозиготен по seu-1. (E) Двойной AP1-3 SEU-1 цветок-мутант.Обратите внимание на полное отсутствие лепестков и мутовки плодолистика 1. органы с роговидными выступами (стрелки). Вторичные цветки отсутствуют. (F) Цветок ap1-3, гетерозиготный по seu-1. Обратите внимание полная потеря лепестков и образование карпеллоидных мутовок 1 органов (стрелки) в главном и вторичном цветках. (G) An ap1-1 цветок. (H) Соцветие ap1-1. (I) Цветок двойного мутанта ap1-1 seu-1, который дал цветы вторичного и высшего порядка. Многие из цветов имеют карпеллоид чашелистики (стрелки).(J) Соцветие ap1-1 seu-1 двойное мутантное растение. Соцветие напоминает цветную капусту, но гораздо больше. цветочные меристемы высшего порядка.

Напротив, двойные мутанты ap1-1 seu-1 (Рис. 2I, J) более резкое усиление дефектов меристемы с напоминающими соцветия, но будучи менее тяжелыми, чем у ap1 cal double мутанты. Каждая цветочная меристема дала начало вторичной цветочной меристеме, которая сгенерированные меристемы третичного и более высокого порядка (Рисунок.2J). В конце концов, эти цветочные меристемы, дифференцированные в цветки с плодолистным первым оборотом органов (рис. 2J) и уменьшенного плодородие. seu-1 / + гетерозиготы также усиливали ap1-1, давая поднимаются до более выраженных дефектов меристемы, чем одиночные ap1-1 мутанты (данные не представлены). Наши данные убедительно подтверждают функциональную значимость Взаимодействие AP1-SEU, не только в идентичности органов спецификации, но также и в спецификации идентичности меристемы.

SEU и LUG модулируют транскрипционную активность AP1 и SEP3 в дрожжах

Чтобы выявить молекулярный механизм, лежащий в основе взаимодействия между AP1 / SEP3 и SEU, мы проверили, действительно ли прямое взаимодействие между AP1 и SEU или между SEP3 и SEU в дрожжах может привести к привлечению LUG и последующее подавление экспрессии репортерного гена.Дрожжи, содержащие интегрированный репортер GAL7-lacZ был трансформирован с помощью AP1-BD или SEP3-BD в присутствии или в отсутствие SEU или LUG. AP1-BD и SEP3-BD ранее были сообщили об активации репортера lacZ через их C-концевой домен (Хонма и Гото, 2001) (Рис. 3A, дорожки 3, 9). Этот активность AP1-BD или SEP3-BD снижалась на 50-62% при SEU был индуцирован галактозой (рис. 3А, дорожки 4, 10). Поначалу это было неожиданно, так как Ранее было показано, что SEU-BD не проявляет репрессорной активности, когда привязанный к гетерологичным промоторам GAL4-BD (Шридхар и др., 2004). В сокращение lacZ за счет SEU, вероятно, будет связано с прямым физический блок С-концевого домена AP1 и SEP3 посредством SEU. lacZ экспрессия была дополнительно снижена до фонового уровня, когда LUG вводится вместе с СЭУ (рис. 3А, дорожки 6, 12). В отсутствие SEU LUG не проявлять любую репрессорную активность в дрожжах, экспрессирующих AP1-BD или SEP3-BD (рис. 3A, переулки 5, 11). Требование к SEU в посредничестве LUG дополнительно продемонстрировал отсутствие усиленного подавления когда LUG _delta LUFS (LUG без домена LUFS) вместо полноразмерная LUG была введена в дрожжи, экспрессирующие AP1-BD или SEP3-BD вместе с SEU (Рисунок.3А; переулки 8, 14). LUG _delta LUFS больше не может взаимодействовать с SEU (Sridhar et al., 2004) и был невозможно задействовать для репрессии репортерного гена.

Активация транскрипции и репрессия AG могут быть опосредовано AP1 и SEP3

Ранее было показано, что второй интрон AG направляет Экспрессия репортера GUS в паттерне, идентичном эндогенному AG (Busch et al., 1999; Зибур и Мейеровиц, 1997). Репортер pAG-I :: GUS ответил LUG регулирование (Зибурт и Мейеровиц, 1997).Второй интрон AG можно разделить на два неперекрывающиеся, но функционально избыточные 5 'и 3' энхансеры (Busch et al., 1999; Дейхолос и Зибурт, 2000). 3'-энхансер содержит сайты связывания для LFY и WUSCHEL (WUS), как а также два блока CArG, сайты связывания с мишенью белков MADS-бокса. Тестировать Активность AP1, SEP3, LUG и SEU в биологически значимых контекст, мы построили LUC-репортер, управляемый 3 ' энхансер (pAG3′I :: LUC; Рис. 3Б).

Поскольку прямая регулирующая роль AG со стороны AP1 или SEP3 не был установлен, мы сначала проверили, действительно ли AP1 или SEP3 может регулировать pAG3'I :: LUC выражение.В переходном анализе с использованием эпидермальных клеток лука pAG3′I :: LUC ответил на AP1 и Активация SEP3 (рис. 3C, дорожки 2, 6), при этом SEP3 показывает более высокую транскрипцию активатор активности, чем AP1. Чтобы проверить, действительно ли LUG и SEU может подавлять положительный регуляторный эффект AP1 и SEP3 на репортере pAG3′I :: LUC, 35S :: SEU или 35S :: LUG были котрансфицированы с 35S :: AP1 или 35S: SEP3. 35S :: LUG сама по себе не мешает Действия AP1 или SEP3 (Рис. 3C, дорожки 3, 7). От напротив, 35S :: SEU снижает уровень экспрессии LUC до 48-55% (рис.3C, дорожки 4, 8). Одновременное внедрение 35S :: LUG и 35S :: SEU в эпидермальные клетки лука дополнительно снижают экспрессию репортера примерно до 24-26% (Рис. 3C, дорожки 5, 9), предполагая, что через взаимодействие с SEU, LUG набирается репортеру pAG3′I :: LUC, чтобы подавить его экспрессию. Этот результат предполагает, что AP1 и SEP3 могут действовать на AG 3 'энхансер, возможно, через два блока CArG. Подобно результаты, полученные из экспрессии репортерного гена в дрожжах (Рис. 3A), AP1 и SEP3 просто превращаются из активаторов транскрипции в репрессоры. за счет их взаимодействия с корепрессором SEU / LUG.

AP1 и SEP3 опосредуют репрессорную активность SEU / LUG. (A) AP1-BD и SEP3-BD, с GAL4 BD на N-конце слитых белков, опосредует репрессорная активность SEU / LUG в дрожжах, на что указывает β -галактозидазная активность репортера GAL7-lacZ. AP1-BD (дорожка 3) и SEP3-BD (дорожка 9), но не BD (pGBT9 вектор; дорожки 1-2), активируют экспрессию lacZ. Эта деятельность снижается в присутствии SEU (дорожки 4, 10). Полная длина LUG (дорожки 5, 6, 11, 12) и LUG без домена LUFS (LUG _delta LUFS; дорожки 7, 8, 13, 14) были протестированы в наличие или отсутствие SEU.Планки погрешностей показывают стандартное отклонение средствами трехкратного анализа. (B) Схема pAG3′I :: LUC репортер. Фрагмент ∼900 п.н. из 3 'энхансер AG вставлен перед ТАТА-боксом 35S промотор, который управляет люциферазой светлячков (LUC). Два Сайты связывания LFY / WUS (черные кружки) и два блока CArG (ромбы) обозначены. (C) AP1 и SEP3 опосредуют репрессия репортера pAG3′I :: LUC в луке клетки. Соотношение pAG3′I :: LUC и 35S :: Renilla Показано выражение LUC. Эпидермальные клетки лука временно были преобразован с помощью 35S :: AP1 или 35S :: SEP3 вместе с 35S :: SEU или 35S :: LUG, или 35S :: SEU plus 35S :: LUG.Вектор pART7 был отрицательным контролем. Ошибка столбцы показывают стандартное отклонение средних значений трех анализов.

SEU напрямую связан с AG 3 ′ энхансер in vivo

Хотя предыдущие генетические и молекулярные анализы показали, что LUG и SEU оказывают негативное регулирующее влияние на AG через второй интрон AG (Зибурт и Мейеровиц, 1997), наша вторая модель, которую LUG / SEU подавляет AG путем подавления экспрессии позитивных регуляторов AG такие как LFY или WUS, не могут быть исключены.С помощью анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP), мы исследовали, непосредственно связывается с энхансером AG 3 'in vivo. Хроматин выделен из соцветий дикого типа и seu-3. осаждается антителом против SEU (αSEU Ab). seu-3 - это бессмысленная мутация в остатке 127 (Pfluger и Zambryski, 2004), что приводит к усеченному белку SEU без эпитопа для αSEU Ab. ΑSEU Ab смог последовательности иммунопреципитата в энхансере AG 3 '(AG-3), но не последовательности в 5'-энхансере (AG-5) (Рисунок.4А, Б). Кроме того, Зонд AG-3 осаждали только из хроматина дикого типа, а не из seu-3 хроматин. Таким образом, белок SEU связан с 3 'энхансер АГ, поддерживающий прямую регуляторную роль SEU в репрессиях АГ. Связь белка SEU с 3'-энхансер, но не 5'-энхансер, согласуется с результаты, показанные на рис. 3, где AP1 и SEP3 действуют на AG 3 ′ усилитель.

ОБСУЖДЕНИЕ

SEU взаимодействует с C-концевым доменом AP1 и SEP3

Молекулярная основа комбинаторного действия генов ABCE лежит в сборка четырех различных комплексов факторов транскрипции MADS-бокса в четырех цветочные завитки, чтобы указать четыре типа цветочных органов (Тайссен и Сэдлер, 2001).Среди генов MADS-бокса, принадлежащих к классам A, B, C и E, AP1 и SEP3 уникальны тем, что их C-концевой домен обладает сильным активность активации транскрипции (Cho et al. др., 1999; Хонма и Гото, 2001), которые могут поставляться в тройные белковые комплексы. В кроме того, C-концевые домены SEP3 и SQUA, Antirrhinum ортолог AP1, как было показано, опосредует образование более высокого порядка Белковые комплексы MADS box (Egea-Cortines et al., 1999; Хонма и Гото, 2001).

Ассоциация белка SEU in vivo с AG 3 ' усилитель. (A) Схема второго интрона AG, который совпадает с фрагментом HindIII размером ~ 3 т.п.н. (Бао и др., 2004; Буш и др., 1999; Дейхолос и Зибурт, 2000). Цифры указывают на нуклеотидную последовательность, а 5 'HindIII сайт обозначен как 1. Расположение сайтов связывания LFY / WUS (назад кружки), боксы CArG (ромбы) и сайты связывания BLR (треугольники) указано. Два "избыточных" энхансера, определенных KB14 (5 'энхансер) и репортерные линии KB18 (3 'энхансер) (Busch et al., 1999), а также как позиции продуктов ПЦР AG-5 и AG-3, показано. Фрагмент AG ∼900 п.н. Указан репортер pAG3′I :: LUC. Рисунок не для шкала. (B) Ассоциация SEU с энхансером AG 3 ' выявляется с помощью ChIP с антителом против SEU. AG-5 и AG-3 являются продуктами ПЦР. обнаружение иммунопреципитированного хроматина дикого типа и seu-3, соответственно. Контрольный праймер E1F4P амплифицирует нерегулирующую мишень LUG / SEU. «Нет Ab» и «αSEU Ab» соответствуют хроматину, обработанному без или с антителами против SEU соответственно.

Взаимодействие между SEU и C-концевым доменом AP1 или SEP3 указывает на то, что AP1 и SEP3 также взаимодействуют с белками, не относящимися к MADS-боксу, через свои С-концевой домен. Это наблюдение предполагает захватывающий и новый механизм. в котором SEU может конкурировать с другими белками MADS-бокса за связывание с С-концевой домен AP1 и SEP3. Ранее сообщалось, что только SEU-BD не проявляют репрессорной активности при привязке к гетерологичным промоторам (Шридхар и др., 2004). В снижение способности AP1 и SEP3 активировать репортерный ген экспрессия в присутствии SEU согласуется с механизмом в который SEU, конкурируя за связывание с одним и тем же C-концевым доменом AP1 / SEP3, предотвращает взаимодействие других коактиваторов транскрипции с AP1 / SEP3.В дрожжей, репрессорный эффект SEU может быть результатом физического блока C-концевого домена AP1 и SEP3 посредством SEU, что делает C-концевой домен, недоступный для механизмов активации транскрипции дрожжей. Следовательно, репрессорный эффект SEU отличается от LUG, который зависел от гистоновых деацетилаз (Шридхар и др., 2004). В рекрутирование LUG посредством SEU дополнительно снижает экспрессию целевого гена.

SEU и AP1 могут функционировать вместе для регулирования идентичность цветочной меристемы, а также идентичность цветочных органов

Ранее было показано, что мутации в AP1 нарушают два последовательных этапы развития цветка: спецификация меристемы цветка и орган цветка спецификация идентичности (Bowman et al., 1993; Ирландия и Сассекс, 1990). Эти две последовательные функции AP1: отражается паттерном экспрессии мРНК AP1, который изначально выражается во всем молодом цветочном зачатке, но позже (на стадии 3) присутствует только в двух внешних оборотах (Mandel et al., 1992). В исключение AP1 из двух внутренних оборотов является результатом репрессии со стороны АГ (Густафсон-Браун и др., 1994).

Цветная капуста (CAL), которая очень похожа на AP1 и LFY, фактор транскрипции, действуют вместе с AP1 для регулирования идентичности меристемы (Феррандиз и др., 2000; Weigel et al., 1992). AP1, CAL и LFY способствуют развитию цветков не только положительно. регулируя гены идентичности органов цветка, но также подавляя экспрессию другого белка MADS-бокса, AGL24, для предотвращения идентичности побегов (Yu et al., 2004). Большая часть признаки соцветия в lfy, ap1 single и ap1 cal1 было показано, что двойные мутанты являются результатом эктопической экспрессии AGL24, и AGL24 оказался непосредственной мишенью транскрипции. репрессия AP1 (Yu et al., 2004 г.). Наше наблюдение, что двойные мутанты ap1-1 seu-1 накапливают индетерминантные меристемы соцветий аналогично ap1-1 cal1 указывает, что SEU может помочь AP1 в репрессия AGL24.

Как только цветочная судьба определена, AP1 входит в класс A активность, определяющая идентичность чашелистиков и лепестков. Карпеллоидные цветочные органы в Двойные мутанты ap1-1 seu-1 и ap1-3 seu-1 указывают на то, что AP1 участвует в негативной регуляции AG в внешние два оборота, возможно, из-за его ассоциации с корепрессором SEU / LUG. Наши данные, указывающие на роль AP1 в репрессии АГ, являются подтверждено предыдущими генетическими исследованиями Bowman et al. (Bowman et al., 1993), который наблюдались стаминоидные или карпеллоидные прицветники в обороте 1 в медиальном положении в слабые аллели ap1 и лепестковые тычинки и тычинки на обороте 2 слабые и промежуточные аллели ap1, указывающие на эктопический АГ экспрессия в слабых мутантах ap1.

Двойная роль SEP3 в активации цветочного гомеотического гена и MADS-бокса образование комплекса

Гены идентичности органов цветка SEP1, SEP2 и SEP3 были сначала описано как необходимое, хотя и избыточно, для нормального развитие лепестков, тычинок и плодолистиков, как тройное сеп1 / 2/3 мутанты развили цветки с индетерминантными завитками чашелистиков, фенотип который отражает двойные мутанты генов B и C (Пелаз и др., 2000). Недавно сообщалось о SEP4, а sep1 / 2/3/4 четырехкратное мутанты развивают индетерминантные цветки только с листообразными органами (Дитта и др., 2004), указывает на то, что все гены A, B и C требуют функции SEP гены. Сообщается, что это требование относится к образованию мультимерных комплексы с белками SEP, обеспечивающие функцию активации транскрипции до комплекса (Хонма и Гото, 2001).

Два недавних исследования показали, что SEP3 функционирует на других уровнях. помимо того, что он является членом органо-специфических белковых комплексов MADS-бокса. Во-первых, было обнаружено, что АГ саморегулирует собственную транскрипцию. (Gomez-Mena et al., 2005) и эта положительная ауторегуляция AG требует комплекса AG / SEP3.Во-вторых, трансгенные линии 35S :: SEP3 привели к гомеотическому трансформация чашелистиков в карпеллоидные структуры (Castillejo et al., 2005). Следовательно, АГ необходимо активировать эктопически в 35S :: SEP3. растения. Те же исследования также показали, что эктопический SEP3 приводит к эктопическая экспрессия AP3. Таким образом, SEP3 функционирует как компонент органоспецифического белкового комплекса MADS box, и как транскрипция активатор генов класса B и C.

AP1 и SEP3 могут функционировать как активаторы, так и репрессоры

Многие факторы транскрипции, включая белки MADS-бокса, могут функционировать как активаторы, так и репрессоры в зависимости от их взаимодействия с соактиваторы или ко-репрессоры.Например, УСИЛИТЕЛЬ МИОЦИТА FACTOR-2 (MEF2) MADS-бокс-белок способен репрессировать или активация транскрипции путем ассоциации с множеством ко-репрессоров или соактиваторы кальций-зависимым образом (Хан и др., 2003). Следовательно, AP1 может положительно регулировать гены идентичности органов, такие как AG на ранней стадии определения меристемы и отрицательно регулируют АГ на более поздней стадии определения идентичности органа путем связывания с разными сопутствующими факторами. Функция SEP3 как активатора AG (в комплексе AG / SEP3) и как репрессор AG (в предполагаемый комплекс SEP3 / SEU / LUG) может объяснить, почему эктопический АГ не наблюдается у sep triple или sep quadruple мутантов, потому что роль SEP3 в активации АГ эпистатична роли SEP3 в репрессии AG.

Предлагаемая модель

Как LUG и SEU проявляют свои внешние завитки, специфичные для репрессорное действие на АГ? Мы предложили три альтернативные модели. Во-первых, комплекс LUG / SEU может взаимодействовать с ДНК-связывающими партнерами. которые особенно выражены в двух внешних мутовках цветка. Второй, комплекс LUG / SEU может регулировать AG косвенно, подавляя экспрессия положительного регулятора АГ. В-третьих, SEU / LUG может подавлять AG во всех четырех оборотах, а некоторые факторы во внутреннем два оборота могут противодействовать репрессорному эффекту LUG / SEU.

Обнаружение AP1 как ДНК-связывающего партнера SEU / LUG, на первый взгляд, кажется, поддерживает первую модель. Однако несколько предыдущие наблюдения не согласуются с ролью AP1 в обеспечение внешней оборотной репрессорной активности AG. Первый в situ гибридизация не выявила эктопическую мРНК AG в сильных мутанты ap1-1, а органы ap1-1 whorl 1 скорее являются прицветниками. чем плодолистики (Gustafson-Brown et al., 1994). Во-вторых, трансгенные растения 35S :: AP1 имеют нормальные тычинки и плодолистики (Gustafson-Brown et al. al., 1994; Мандель и Янофский, 1995), предполагая, что эктопический AP1 во внутреннем два оборота не привели к репрессии АГ. Кроме того, в ag, активность AP1 распространяется на 3 и 4 обороты, но экспрессия мРНК AG оставалась экспрессированной во внутренних двух оборотах. Кроме того, SEP3 экспрессируется во внутренних трех оборотах и не соответствуют критериям того, что он является специфическим для внешней оборота ДНК-связывающим фактором. Прямая связь между SEU и AG 3 ′ энхансер (показан на рис. 4) также помогает исключить вторую модель.

Таким образом, все предыдущие и текущие результаты соответствуют третьему модель, поясняемая на рис. 5. AP1 и SEP3 (и, возможно, другие SEP гены) могут функционировать как ДНК-связывающие партнеры SEU / LUG, сообщая репрессорную активность во всех четырех мутовках цветка. Хотя их репрессорное действие усиливается в оборотах 1 и 2 за счет присутствия других внешние специфические репрессоры, включая AP2 (Боуман и Мейеровиц, 1991; Чен, 2004; Jofuku et al., 1994) и BLR (Бао и др., 2004), он резко ослаблен и антагонизирован в оборотах 3 и 4 активаторами АГ, специфичными для внутреннего оборота. Эти внутренние Положительные регуляторные факторы, специфичные для оборота, включают комбинированную активность LFY и WUS (Lenhard et al. al., 2001) и положительной ауторегуляции комплексом AG / SEP3 (Гомес-Мена и др., 2005). Кроме того, комплекс AG / SEP3 ингибирует транскрипцию AP1 и взаимодействие между AG и SEP3 может препятствовать совместному репрессору SEU / LUG взаимодействует с SEP3. В результате репрессия АГ происходит только в оборотах. 3 и 4.Таким образом, мы предлагаем, чтобы предметно-специфическое выражение AG регулируется множеством факторов, оказывающих противоположные регуляторные воздействие на АГ. Транскрипционная репрессия становится основным регуляторный механизм, лежащий в основе многих ключевых путей развития и сигнальных путей в высшие растения. Например, Arabidopsis WUSCHEL (WUS) недавно было показано, что ген напрямую взаимодействует и задействует транскрипцию корепрессоры для репрессии генов-мишеней, участвующих в поддержании стволовых клеток лужа на верхушке побега (Kieffer et al., 2006 г.). Подобно LUG, эти WUS-взаимодействующие корепрессоры обладают N-концевым доменом LisH и С-концевыми повторами WD. Таким образом, выводы, полученные в результате нашего исследования репрессии транскрипции механизмы и функция белка MADS-бокса актуальны для многих областей растений. биология.

Предложенная модель того, как специфичная для внутреннего оборота активация AG достигается. В 1 и 2 оборотах множественные отрицательные регуляторные деятельность посягает на цис-регуляторный регион АГ (например, Интрон II AG) для предотвращения транскрипции AG.Эти негативные регуляторные факторы включают AP2, BLR и SEU / LUG / AP1 или SEU / LUG / SEP3. В 3 и 4 оборотах множественные положительные регуляторные факторы. противодействовать отрицательному эффекту SEU / LUG / SEP3 по продвижению AG транскрипция. Эти положительные регуляторные факторы включают в себя комбинированные деятельность LFY и WUS, а также положительные авторегуляция AG / SEP3. Кроме того, комплекс AG / SEP3 ингибирует Транскрипция AP1 и взаимодействие между AG и SEP3 могут препятствовать корепрессоры SEU / LUG от взаимодействия с SEP3.Стрелки, ведущие от AP1 или SEP3 к соответствующим комплексам LUG / SEU / AP1, LUG / SEU / SEP3 или AG / SEP3 указывают включение этих белков MADS-бокса в соответствующий белок комплексы.

Идентификация и характеристика варианта MPYS человека с потерей функции

Генотипирование SNP MPYS

Образцы ДНК человека из когорты I были собраны в Медицинском центре Университета Дьюка (протокол IRB 1048) и использованы в Национальном еврейском здравоохранении (протокол IRB HS2255) ). Образцы ДНК человека из когорты II были собраны и использованы в Вашингтонском университете, отдел легочной медицины и реанимации (протокол IRB 03-8666).Генотипирование выполняли с использованием заказных зондов Taqman и смеси для генотипирования 2xTaqman в системе обнаружения последовательностей Applied Biosystems 7900 в соответствии со стандартными протоколами производителя. Каждая 15-мкл реакционная смесь содержала 15 нг геномной ДНК. Генотипы определяли с помощью программного обеспечения SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Все исследования на людях были выполнены в соответствии с Руководством Министерства здравоохранения и социальных служб США и одобрены соответствующими институциональными наблюдательными советами.

Секвенирование экзонов MPYS

Праймеры были сконструированы для амплификации экзонов (1-2), экзонов (3-4-5), экзона 6, экзона 7a и экзона (7b-3'UTR) (дополнительная таблица 1). ПЦР проводили с ДНК-полимеразой PrimeSTAR (TaKaRa, Мэдисон, Висконсин, США, R010A) в следующих условиях: 98 ° C 1 мин, 32 цикла 98 ° C 10 с, 60 ° C 5 с и 72 ° C 1 мин, затем 72 ° C в течение 5 мин. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA, 28106) и напрямую секвенировали с использованием Agencourt Genomic Service.

Клеточная культура

Клетки 293MT субкультивировали из клеток 293GT ¹² в среде Игла, модифицированной Дульбекко (GIBCO, Карлсбад, Калифорния, США, кошка: 11965), 5% фетальной телячьей сыворотке (Biosource, Камарилло, Калифорния, США). США, 200p-500HI), пируват натрия (GIBCO, 11360, 1 мМ), буфер HEPES (GIBCO, 15630-080, 10 мМ) и 2-меркаптоэтанол (50 мкМ) (Life Technologies, Гейтерсбург, Мэриленд, США). Субкультивированные клетки 293GT, которые стимулируют продукцию IFNβ после сверхэкспрессии MPYS, были выбраны как клетки 293MT.

Анализ репортерного гена

Клетки высевали в 24-луночные чашки (∼1 × 10 ⁵ мл ^-1 ) и трансфицировали на следующий день с использованием набора реагентов для трансфекции Effectene (Qiagen, 301427). Репортерные анализы выполняли, как описано ранее. ¹³ Все эксперименты были повторены не менее трех раз, и результаты являются репрезентативными.

Измерение продукции IFNβ

Продукцию IFNβ человека измеряли с использованием набора Verikine Human IFN-β ELISA (источник интерферона PBL, Piscataway, NJ, USA, 41410).Вкратце, клетки 293MT культивировали с 500 мкл среды Игла, модифицированной Дульбекко, в 24-луночном планшете, как и раньше. ДНК MPYS трансфицировали в клетки, как описано выше. Через 24 ч среду собирали. Иммуноферментный анализ проводили с использованием планшета с предварительно нанесенным покрытием в соответствии с протоколами производителя. Предел обнаружения IFNβ составляет 50–4000 пг / мл ^–1 .

Иммунопреципитация

Клетки лизировали в 0,33% буфере CHAPS (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис pH 7,5, 10 мМ пирофосфат натрия, 2 мМ Na ₃ VO ₄ , 10 мМ NaF, 0.4 мМ EDTA, 1 мМ PMSF и 1 мкг мл ^-1 каждого из апротинина, α ₁ -антитрипсина и лейпептина) при 4 ° C в течение 1 часа. Лизаты клеток центрифугировали при 12 000 g при 4 ° C в течение 10 мин. Иммунопреципитацию проводили в лизатах с указанными шариками сефарозы, конъюгированной с антителами.

Инфекция Listeria monocytogenes

Клетки инфицировали штаммом Listeria monocytogenes 10403S при множественности пяти бактерий на клетку. Клетки промывали через 1 ч после заражения. Живые бактерии убивали добавлением гентамицина.Супернатант собирают через 18 ч после заражения.

Внутриклеточное окрашивание

Клетки собирали и промывали в буфере FACS (забуференный фосфатом физиологический раствор с 2% фетальной телячьей сывороткой, 0,05% азидом натрия и 0,2 мкг мл ^-1 2,4 г2 антитела, блокирующего Fc-рецептор). Затем клетки ресуспендировали в буфере BD Cytofix / Cytoperm (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США, 554722) в течение 20 минут при комнатной температуре. Буфер BD Perm / Wash (BD Bioscience, 554723) добавляли в суспензию клеток.Клетки собирали и снова промывали BD Perm / промывочным буфером. Затем клетки суспендировали в буфере для промывки BD Perm, содержащем окрашивающие антитела, в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки собирали и дважды промывали BD Perm / промывочным буфером, затем анализировали с помощью FACSCalibur. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Flow-Jo (Tree Star Inc., Сан-Карлос, Калифорния, США).

Восстановление макрофагов костного мозга

Макрофаги костного мозга мышей STING - / - реконструировали конструкцией MSCV-green fluorescent protein (GFP), экспрессирующей MPYS, HAQ или vec.Вкратце, конструкцию MSCV-MPYS-GFP, MSCV-HAQ-GFP или MSCV-Vec-GFP трансфицировали в клетки амфотропного феникса для получения ретровируса. Через 48 ч супернатант собирали и использовали для спин-инфекции клеток костного мозга, как и раньше. ¹⁴ Затем клетки костного мозга культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки, 10% L-CSF, 1 мМ пируват натрия, 2 мМ L-глутамин, 100 ед. Мл ^-1 пенициллин, 100 мкг мл ^-1 стрептомицина и 50 мкМ 2-ME.Через 7 дней клетки исследовали на экспрессию F4 / 80. Затем GFP-положительные клетки сортировали и использовали для экспериментов.

Драфт НБА 2020: ¿Cómo de engañosa puede ser la falta de experiencecia de James Wiseman? | NBA.com España

Джеймс Уайзман - это не то, что вам нужно, это загадочный проект для первых игроков драфта-2020 в НБА.

Dueño de una capidad atlética asombrosa y un físico Privégiado de 2,16 metros, el pívot de 19 años llama la atención de los scouts des su adolescencia, cuando se fue transformando en el main objetivo de reclutam equipos de var. del Baloncesto Universitario.

Sin embargo, pudieron nada no verlo poc el baloncesto profesional pero que ya presenta algo muchísimo más Competitivo que los torneos escolares: el natural de Nashville, Tennessee, se perdió los amistosos de pretemporada por distintas lesiones y luego apenas pudo jugar tres partidos de la temporada de la temporada регулярный jugar en la NCAA, debido a una sanción referida a su processso de reclutamiento por la Universidad de Memphis.En diciembre de 2019, tras cumplir unos partidos de una sanción que iba a ser reducida, Wiseman decidió irse de Memphis y prepararse para el Draft de la NBA, sin conocer lo caótico que sería el año 2020.

MÁS | La Guía del NBA Draft 2020: cómo funciona, jugadores disponibles, mejores proyectos y más

Ahora el pívot está a dos días de cumplir un año sin jugar partidos oficiales y apenas disputó tres encuentros, чтобы получить 500 результатов gran ¿ventaja o desventaja? para él.Нет возможности действовать в надежном месте, как доминирующее оружие в превосходном состоянии, и в этом случае, если вы говорите о «обмане», и о том, что вы хотите узнать больше о лас-франкисиас в НБА.

Место средней школы в средней школе: 25,8 баллов, 14,8 баллов и 5,5 баллов на улице Ультимо-аньо-эсколар и кондитерские изделия с различными уровнями подготовки и развития. También ha mostrado buen nivel en las selecciones formativas de Estados Unidos, consagrándose en el FIBA ​​Américas Sub 16 disputado en Formosa, Argentina (2017), aunque al año siguiente les tuvo el infortunio de no poder jugar el campeonato un mundial Sub-17.

MÁS | ¿Cómo juega Джеймс Уайзман? Perfil y scouting del posible pick número uno

En el baloncesto Universe Wiseman promedió 19,7 puntos, 10,7 rebotes y 3 tapones en 23 minutos, tirando un 76,9% de campo, pero sus primeros dos rivales (штат Южная Каролина e Illinois-Chicago) fueron dos de muy bajo nivel, y Memphis ganó por 33 y 46 puntos respectivamente. La única prueba seria para Wiseman fue enfrentarse a Oregon como visitante, partido en el que finalizó con 14 tantos, 12 rebotes y un tapón, cometió 3 personales en 22 minutos en cancha y Memphis perdió por 82-74, con el joven ya en medio del escándalo por su sanción.Нет jugó mal, pero no deslumbró. Y no se volvió a ver más de él.

El pívot decidió prepararse por su cuenta para el Draft, pero no se ha podido verlo enfrentar a otros jugadores de forma seria. Para colmo, las limitaciones que le ha impuesto la pandemia del Covid-19 и los entrenamientos previos al Draft que se realizan normalmente han impedido verlo a Wiseman midiéndose ahí con otros jóvenes destacados de su camada. El equipo que lo escoja deberá realizar un acto de fe importante con una evalación mucho más limitada respo a la que se puede hacer con otros proyectos top como LaMelo Ball (jugó solamente 12 partidos pero fueron a nivel profesional en Edwards), partidos en NCAA) o Deni Avdija (профессиональный опыт в Израиле y hasta más de 30 partidos jugados en Euroliga).

Cierto es que las características físicas de Wiseman serían las mismas haya jugado en NCAA, G-League, China o Escocia, pero el nivel de los rivales Influye para medir todo lo demás, desde su tecnica hasta los нематериальные активы.

MÁS | Mock Draft 2020: ¿Cómo se perfilan las 30 selecciones de la 1 ° Ronda?

Igualmente, el suyo no es el primer caso similar de un jugador que llega al Draft en un context así.

Darius Garland, elegido quinto en el último Draft por Cleveland Cavaliers, apenas había disputado cinco partidos en la NCAA, quedando fuera de la temporada por una lesión en los meniscos de la rodilla izquierda.Состоит из числа новичков НБА с 12,3 очков и 3,9 очков в Кливленде, который является главным героем, главным образом, для подготовки.

Эль-Драфт, выбравший в свое время Эль Драфт, который был выбран в Эль-Драфте, в 2011 году. pesar de no haber podido jugar ni un partido en la NCAA debido a una sanción similar a la de Wiseman y su adapación a la NBA le llevó un tiempo, tomando un rol importante recién en su terceraña, además de que terminó siendo una elecciendo Visto el rendimiento de Kanter en la NBA y el de otros jugadores de su camada.

Para otros jugadores seleccionados dentro del top 10 con poca Experimentcia previa de un cierto nivel ya hay que remontarse al Draft del 2005, el último que Разрешение que los jugadores salten directamente desde high school a NBA. Martell Webster, elegido sexto en aquel Draft por Portland Trail Blazers, jugó solamente 260 титульных участников НБА в 2005 и 2015 годах. Эндрю Байнум, лучший выбор аквеля в драфт, fue otro que llegó joven e Experto pero tras dos años se Adaptó y Пройдя через «Лос-Анджелес Лейкерс», прошел чемпионат в 2009 г., 2010 г. и Все-НБА в 2012 г., прошел 26 дней в течение 26 дней с поражением родильи, который закончился на каррере.

Дуайт Ховард и Леброн Джеймс, выборы, сделанные в 2004 г. и 2003 г., доминируют в НБА с высоким потенциалом, который несут в себе демострабан и нивел-эсколар, прямое указание на все профессиональные, предыдущие случаи, когда Кваме Браун (№ 1 ), Дариус Майлз (# 3 дель 2000), ДеСагана Диоп (# 8 дель 2001) и Джонатан Бендер (# 5 за 1999) lejos estuvieron de los resultados deseados por las franquicias que apostaron por ellos.

La mayoría de estos casos no fueron gran cosa y terminaron engañando un poco.Pero también está la шанс de dejar pasar a un talento generacional: su Capacidad atlética es algo que no se enseña.

Sin dudas es una decisión arriesgada que puede costarle el futuro a una franquicia y a sus directivos responsables del Draft, con mucho por ganar y perder ante una apuesta tan poco segura. Pero en un Draft con tan pocas cosas claras por este context to extraordinario, será solamente cuestión de que alguno se atreva a jalar el gatillo creyendo en él, en un pivote que pueda revolucionar la NBA de los perimetrales.

Последние отзывы о водах НБА или организациях.

Генетический анализ ауксиновых рецепторов TIR1 / AFB арабидопсиса выявляет как перекрывающиеся, так и специализированные функции

Семейство белков TIR1 / AFB расширилось за счет серии событий дупликации генов, которые начались до дивергенции папоротник – семя – растение. Несмотря на то, что три основных субклада были установлены примерно в 400 млн лет назад (Morris et al., 2018), наши генетические исследования показывают, что для большинства процессов роста, регулируемых ауксином, белки TIR / AFB сохраняют в значительной степени перекрывающиеся функции (Рисунок 8).Поразительным исключением из этого общего утверждения является доминирующая роль AFB1 в быстром ингибировании ауксином роста корней. В целом, TIR1 наиболее важен для нормального роста и развития, но AFB5 и AFB2 и в меньшей степени AFB3 и AFB4 также играют важную роль. Пространственные различия также очевидны; TIR1 играет важную роль в корне, тогда как AFB5 относительно более важен в развитии гипокотиля и соцветий.

Сводная информация о вкладе каждого гена TIR1 / AFB в различные реакции.

Вес линий отражает относительную важность роли каждого гена. Синие линии представляют вклад в быстрое ИУК-опосредованное ингибирование удлинения корня, а красная линия с полосой на конце указывает на антагонистическую роль, наблюдаемую для AFB1 в продукции боковых корней.

Хотя все шесть генов широко экспрессируются, похоже, что относительная важность отдельных белков TIR1 / AFB в различных органах, по крайней мере, частично связана с различиями в экспрессии.Например, AFB5 экспрессируется более широко, чем другие гены в соцветии, в то время как в корне TIR1 и AFB2 экспрессируются наиболее высоко. Ген AFB4 экспрессируется на более низком уровне во всех тканях, что соответствует его относительно второстепенной роли. Также очевидны дополнительные различия в образцах экспрессии, особенно в соцветиях. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, важны ли эти различия.

Наши исследования показывают, что уровни белков TIR1 / AFB неодинаковы по всему растению.Это верно для отдельных членов семьи и для общих уровней TIR1 / AFB в различных тканях и типах клеток. Более ранние эксперименты также показали, что уровни TIR1 / AFB могут быть динамическими в изменяющейся среде (Vidal et al., 2010; Wang et al., 2016). Эти наблюдения могут иметь важные последствия для использования сенсоров ауксина на основе DII-Венеры для оценки относительных уровней ауксина, поскольку уровни сенсорного белка зависят как от ауксина, так и от TIR1 / AFB (Brunoud et al., 2012; Liao et al. , 2015).Принимая во внимание дискуссии об асимметрии ауксинового ответа в зачатках органов побегов (Bhatia et al., 2019; Guan et al., 2019), особенно интересно то, что мы видим асимметричное распределение TIR1-mCitrine в зачатках цветков.

Важно подчеркнуть, что отдельные члены семьи могут выполнять функции в определенных условиях окружающей среды. Например, известно, что микроРНК miR393 нацелена на TIR1, AFB2 и AFB3, но не на других членов этого семейства (Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Navarro et al., 2006). Регулирование количества miR393 модулирует уровни этих трех TIR1 / AFB для облегчения различных процессов роста, таких как формирование боковых корней и удлинение гипокотиля в ответ на сигналы окружающей среды (Vidal et al., 2010; Pucciariello et al., 2018).

Предыдущие исследования in vitro документально подтвердили некоторые различия в биохимической активности членов семейства TIR1 / AFB (Calderón Villalobos et al., 2012; Lee et al., 2014). Аналогичным образом, анализ индуцированной ауксином деградации у дрожжей выявляет различия в поведении TIR1 и AFB2 (Wright et al., 2017). Напротив, наши результаты не показывают какой-либо биохимической специфичности, за исключением AFB1 (см. Ниже). Таким образом, одного аллеля TIR1 или AFB2 достаточно для поддержания жизнеспособности на протяжении всего жизненного цикла растения, хотя и при резком снижении фертильности. Это контрастирует с функциональной диверсификацией, наблюдаемой в других хорошо изученных семействах генов, которые разошлись в аналогичных временных рамках, таких как фоторецепторы фитохромов и регуляторы транскрипции HD-Zip класса III (Prigge et al., 2005; Franklin and Quail, 2010; Strasser et al. ., 2010). Возможно, что сохранение перекрывающихся функций отражает более строгие ограничения на функцию белка TIR1 / AFB. Одна возможность состоит в том, что разные паралоги TIR1 / AFB поддерживаются, потому что они вносят вклад в устойчивость системы передачи сигналов ауксина. Конечно, конкретные функции могут быть выявлены в будущих исследованиях.

Важность ауксина в формировании паттерна развивающегося эмбриона хорошо установлена ​​(Palovaara et al., 2016). Передача сигналов ауксина, о чем свидетельствует активность репортера DR5, сначала проявляется в апикальной клетке эмбриона (Friml et al., 2003). Существенная роль ауксина в апикальной клетке, а затем и в гипофизе четко продемонстрирована дефектами деления этих клеток у четверных мутантов tir1afb235 и шестерых мутантов tir1afb12345 (Рис. 3). Подобные дефекты наблюдаются у ряда других мутантов ауксина, включая те, которые влияют на реакцию (monopteros и bodenlos), синтез ауксина (yuc1 yuc4 yuc10 yuc11 и taa1 tar1 tar2) и транспорт (pin1 pin3 pin4 pin7 и aux1 lax1 lax2) (Berleth and Jürgens, 1993; Hardtke and Berleth, 1998; Hamann et al., 1999; Хаманн и др., 2002; Friml et al., 2003; Cheng et al., 2007; Степанова и др., 2008; Роберт и др., 2015). Однако ни одна из этих линий не проявляет полностью пенетрантного эмбрионетального фенотипа, наблюдаемого для четверных мутантов tir1afb235 и шестерых мутантов tir1afb12345. У других мутантов значительные фракции эмбрионов избегают гибели эмбрионов и прорастают, хотя часто и в виде проростков без корней.

Экспрессия ключевых эмбриональных маркеров у мутантов также выявляет глубокие дефекты формирования эмбрионального паттерна на стадии дерматогена.Хотя эмбрионы tir1afb235 образуют морфологически нормальную клетку гипофиза, эта клетка никогда не экспрессирует NTT-YPet или WOX5: GFP. Пролиферация суспензорных клеток у мутанта связана со сниженной экспрессией маркера суспензора PIN7-Venus и, в меньшей степени, NTT-YPet, что позволяет предположить, что путь TIR1 / AFB необходим для поддержания судьбы суспензорных клеток, что согласуется с более ранним исследованием ( Радемахер и др., 2012). PIN1-Venus обычно экспрессируется в большинстве клеток дистальнее гипофиза у глобулярных эмбрионов и в проваскулярной ткани у более поздних эмбрионов, но он экспрессируется преимущественно в апикальных протодермальных клетках у мутантов tir1afb235 (Figure 4M – N).Это напоминает его паттерн у мутантов monopteros, где появляется некоторая протодермальная экспрессия, хотя проваскулярная экспрессия сохраняется (Breuninger et al., 2008). Поскольку как спецификация семядолей, так и экспрессия PIN1 находятся под влиянием восприятия ауксина, неясно, лишены ли мутантные эмбрионы радиальной асимметрии, которая предсказывает расположение семядолей, или не могут уточнить эту асимметрию. Было удивительно наблюдать, что PIN7-Venus проявляет эктопическую экспрессию в собственно эмбрионе.Причина этого неясна, но экспрессия PIN7 обычно может подавляться в эмбрионе с помощью TIR1 / AFB-зависимого пути. Учитывая, что PIN1 и PIN7 обычно экспрессируются в неперекрывающихся доменах у эмбриона (Friml et al., 2003), одна возможность состоит в том, что снижение экспрессии PIN1 у мутантов позволяет PIN7 экспрессироваться за его нормальные границы.

В отличие от эмбриона роль ауксина в развитии гаметофита неясна. Несколько сообщений предполагают, что ауксин играет важную роль в формировании паттерна женского гаметофита (Pagnussat et al., 2009; Паноли и др., 2015; Лю и др., 2018). Другие выступают против роли ауксина, основываясь на теоретических соображениях, а также на отсутствии доказательств ответа на ауксин с использованием нескольких репортеров ауксина (Lituiev et al., 2013). Наши исследования показывают, что ауксиновые рецепторы TIR1 / AFB не требуются для развития гаметофитов, хотя мы не можем исключить второстепенную роль. Важно отметить, что мы не исследовали напрямую развивающиеся шестерые гаметофиты, и, возможно, есть незначительные дефекты, которые не влияют на жизнеспособность.Мы также не можем исключить возможность переноса белков TIR1 / AFB из материнской ткани. Наконец, возможно, что ауксин необходим, но действует неканоническим путем, например, связывающим ауксин с белком ETTIN (Simonini et al., 2016).

AFB1 является уникальным среди корецепторов ауксина и, по-видимому, претерпел явные функциональные изменения во время диверсификации отряда Brasssicales после дупликации TIR1 – AFB1 в At-β WGD около 80-90 миллионов лет назад (Рисунок 1 - дополнение к рисунку 1C; Edger et al., 2018). Хотя AFB1 может взаимодействовать с белками Aux / IAA ауксин-зависимым образом, он, по-видимому, не собирается в комплекс, содержащий Skp, Cullin, F-box (SCF) так же эффективно, как другие TIR1 / AFB, и не локализуется в первую очередь в ядро, где он может напрямую влиять на транскрипционные ответы (Dharmasiri et al., 2005; Yu et al., 2015; Рисунок 5N и S; Рисунок 5 - приложение к рисунку 2C – D). Замены F-Box в AFB1, влияющие на сборку SCF, появились примерно между 45 и 65 миллионами лет назад (Рисунок 1 - приложение к рисунку 1C; Edger et al., 2018). Примечательно, что в отличие от других генов TIR1 / AFB, которые широко экспрессируются в большинстве клеток, AFB1 очень сильно экспрессируется в некоторых тканях (эпидермис корня и сосудистая ткань) и совсем не экспрессируется в других (меристематический перицикл и ранние эмбрионы). Основываясь на наших генетических исследованиях, AFB1, по-видимому, оказывает отрицательное влияние на инициацию бокового корня в линиях afb234 и afb345, ​​несмотря на тот факт, что AFB1 не экспрессируется в перицикле, участке инициации бокового корня, что позволяет предположить, что это может быть не клеточно-автономный эффект.

Мы обнаружили, что AFB2 - AFB5 распределяются между ядром и цитоплазмой, по крайней мере, в эпидермальных клетках корня (рис. 5S). Напротив, паралоги TIR1 и AFB1 резко различаются по высокому содержанию в ядре и цитоплазме, соответственно. В корнях арабидопсиса обработка ауксином приводит к очень быстрым ответам, включая повышение уровня цитозольного Ca ⁺⁺ , ощелачивание апопласта и ингибирование роста корня (Shih et al., 2015; Dindas et al., 2018; Fendrych et al., 2018). Поскольку эти события происходили слишком быстро, чтобы задействовать транскрипцию, предполагалось, что они не требуют белков TIR1 / AFB. Однако недавние исследования показали, что два быстрых ответа, ингибирование роста корней и деполяризация мембран в корневых волосках, действительно требуют TIR1 / AFB (Dindas et al., 2018; Fendrych et al., 2018). Неожиданно мы обнаружили, что реакция ингибирования роста опосредуется в первую очередь AFB1. Это может отражать высокий уровень AFB1 в цитоплазме.В настоящее время неясно, насколько глубоко консервативна цитоплазматическая локализация AFB1. Возможно, что специализация AFB1 возникла относительно недавно, и что ответственность за быстрый ответ разделяют несколько белков TIR1 / AFB в других линиях растений. Ответ на этот вопрос потребует дополнительной информации о молекулярной основе локализации AFB1.

Было высказано предположение, что быстрый негеномный ответ на ауксин в корне Arabidopsis играет роль на ранних стадиях корневого гравитропизма (Sato et al., 2015), и наши результаты подтверждают эту идею. Хотя мутант afb1 сам по себе оказывает лишь умеренное влияние на гравитропизм, в комбинации с tir1 или tir1afb345, ​​он дает явное снижение ранней реакции на гравитацию. Удивительно, что мутация afb1 оказывает лишь умеренное влияние на гравитропизм корня, учитывая почти полное отсутствие быстрого негеномного ответа на ауксин. Это может быть отражением гравитропного анализа, который мы использовали. Дальнейшие подробные исследования гравитропного отклика могут выявить более существенную роль быстрого отклика.Тот факт, что две линии AFB1-mCitrine, по-видимому, влияют на ранний ответ, а также на угол в фазе плато, указывает на дополнительную сложность. Хотя быстрая реакция на ауксин до сих пор описана только у Arabidopsis, она, вероятно, не уникальна для Brassicales, учитывая, что относительно быстрая гравитропная реакция характерна для различных семенных растений (Zhang et al., 2019). Если быстрый ауксиновый ответ развился до события дупликации TIR1 – AFB1 и предковые TIR1 / AFB вносили вклад как в ядерный геномный, так и в цитоплазматический негеномный ауксиновый ответ, то различия между TIR1 и AFB1 представляют собой элегантный пример субфункционализации AFB1 до роли в негеномный ответ и, возможно, TIR1, специализирующийся на ядерном ауксиновом ответе.Более того, поскольку AFB1 играет основную роль в быстром ответе, но мало или не выполняет никакой функции в ответе транскрипции, мутант afb1 предоставляет полезный инструмент для разделения двух ответов.

Прозрачный ген TESTA12 арабидопсиса кодирует мультилекарственный вторичный переносчик-подобный белок, необходимый для секвестрации флавоноидов в вакуолях эндотелия семенной оболочки в JSTOR

Фенольные соединения, присутствующие в семенниках, влияют на физиологию покоя и прорастания семян.Мы выделили рецессивный мутант Arabidopsis с бледно-коричневыми семенами, прозрачным тестом 12 (tt12), из скрининга пониженного покоя семян. Микроскопический анализ развивающихся и зрелых семенников tt12 выявил сильное снижение отложения проантоцианидина в вакуолях эндотелиальных клеток. Были сконструированы двойные мутанты с tt12 и другими мутантами по пигментации семенников, и их фенотипы подтвердили, что tt12 был затронут на уровне пути биосинтеза флавоноидов. Ген TT12 был клонирован, и было обнаружено, что он кодирует белок, сходный с прокариотическими и эукариотическими вторичными переносчиками, с 12 трансмембранными сегментами, принадлежащими к семейству MATE (экструзия множества лекарственных и токсичных соединений).TT12 специфически экспрессируется в семязачатках и развивающихся семенах. Гибридизация in situ локализовала его транскрипт в слое эндотелия, как и ожидалось по влиянию мутации tt12 на пигментацию флавоноидов семенников. Фенотип мутанта и природа гена предполагают, что TT12 может контролировать вакуолярную секвестрацию флавоноидов в эндотелии семенной оболочки.

«Растительная клетка» выходит 19-й год. В течение трех лет после своей первой публикации он занял первое место по значимости среди основных исследовательских журналов в области наук о растениях, и с тех пор он поддерживает этот стандарт качества.The Plant Cell публикует новые исследования, имеющие особое значение в биологии растений, особенно в областях клеточной биологии, молекулярной биологии, генетики, развития и эволюции. Статьи дают новый взгляд на вещи, который представляет большой интерес не только для специалистов, но и для биологов растений.

Oxford University Press - это отделение Оксфордского университета. Издание во всем мире способствует достижению цели университета в области исследований, стипендий и образования.OUP - крупнейшая в мире университетская пресса с самым широким присутствием в мире.